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荧光偏振 (FP)

荧光偏振 (FP)

 

荧光偏振 (FP) 是一项普遍用于监测不时变更的连系事务的手艺。其可用于评价包罗卵白-抗体连系和 DNA 杂交在内的生物份子彼此感化和酶活性,合用于根本钻研和高通量挑选。

经由历程立体偏振光激起的荧光标记小份子(示踪剂)可发射消偏振水平最高的光,这是由于示踪剂在激起与发射之间的距离时候里疾速削减。但当示踪剂连系一个比之大良多的份子时,它的扭转速率就会变慢,同时发射光依然有大局部发生偏振。

 

 

荧光偏振 G 因子

 

偏振以 milli P 或 mP 为单元表现,其利用检测到的绝对偏振激起光标的目的的垂直 (Iperp) 战争行 (Ipara) 荧光强度丈量值停止计较(参见下文的公式)。利用 G 因子 (G) 校订滤光片、偏振片和单色器等光学元件的影响,此中这些元件会影响偏振值。

 

公式

未连系的示踪剂

连系更大份子的示踪剂

荧光标记的份子或与示踪剂连系的份子越大,mP 值就越大。

荧光偏振 G 因子

荧光偏振比拟其余连系检测的上风

 

荧光偏振能够用来钻研受体-配体彼此感化、卵白-DNA 彼此感化、卵白水解、膜勾当性、酶测定等。荧光偏振检测已胜利用于钻研浩繁靶点,包罗激酶、磷酸酶、卵白酶、G 卵白偶联受体 (GPCR) 和核受体。

以下上风使得荧光偏振检测出格合用于高通量挑选:

  • 均相(无需洗濯步骤)
  • 非喷射性
  • 比率式(单波长)
  • 微型化

在 SpectraMax 多功效微孔板读板机(酶标仪)上停止 IMAP 磷酸二酯酶的测定

 

能够对激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶停止疾速、均相、非喷射性测定,并且合用于检测开辟和高通量挑选。IMAP 检测基于磷酸盐与纳米粒上牢固金属共同物的连系。IMAP 连系实体与磷酸化底物连系时,肽的份子勾当会被转变,附着于肽的荧光标记的荧光偏振 (FP) 会增添(图 1,左图)。在时候分辩荧光共振能量转移 (TR-FRET) 尝试中,有磷酸化底物时,利用铽 (Tb) 供体味引发荧光能量转移(图 1,右图)。这项尝试在时候分辩形式下停止检测,几近消弭了来自尝试组分或挑选化合物的荧光搅扰。TR-FRET 还能矫捷转变底物巨细和浓度。

环核苷酸磷酸二酯酶 (PDE) 是一组可降解 cAMP 和 cGMP 磷酸二酯键的酶,此中 cAMP 和 cGMP 是到场各类生物历程的第二信使。它们在心脏病、聪慧症、烦闷症等范畴具备临床意思,是一类关头的可用药靶标。在此处,咱们展现了若何利用 SpectraMax® 多功效微孔板读板机SoftMax® Pro 软件并接纳 IMAP 手艺来测定 PDE 酶浓缩和按捺曲线。

 

IMAP 偏振和 TR-FRET 磷酸二酯酶尝试准绳

 

图 1:利用荧光标记的底物停止磷酸二酯酶反映。随后增添包罗较大M(III)基底纳米粒的连系溶液。在荧光偏振读数(左图)中,较小的磷酸化荧光底物连系较大的纳米粒会降落底物的扭转速率,并增添其荧光偏振。在 TR-FRET 读数(右图)中,磷酸化底物和铽供体均连系纳米粒,从而使铽供体接近底物上的荧光素受体并完成荧光共振能量转移。

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简化在细胞株开辟中测定 IgG 的任务流程

 

在单克隆抗体开辟和出产的良多阶段,测定 IgG 的发生是关头步骤。经常利用的 IgG 定量测定方式要末须要特别仪器和纯熟职员,比方高效液相色谱法 (HPLC) 和外表搅扰量度法,要末须要耗时的测定法,比方酶联免疫吸附检测 (ELISA)。虽然 ELISA 是一种被普遍承认的卵白定量方式,但它操纵历程时候长,步骤多。此处,咱们先容了在抗体开辟和出产历程中经由历程 Valitacell 的 Valita®TITER 尝试来测定 IgG效价的方式。

基于荧光偏振(FP)手艺ValitaTITER 尝试能够用来检测 IgG Fc 与卵白 G 的彼此感化。96 孔微量滴定板的每一个孔都涂有荧光标记的 IgG 连系肽卵白 G。向孔中增添样本时,卵白 G 份子重悬并与之发生连系。卵白 G 连系抗体时,其份子勾当的速率降落,从而致使荧光偏振值降低(图 2)。

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利用荧光偏振手艺的 ValitaTITER 尝试准绳

图 2:在缓冲溶液中,游离卵白 G 份子更小且扭转速率更快。是以,偏振激起光会发生失偏振(顶图)。当卵白 G 份子连系样本中的抗体时,这类增大复合体的扭转速率就会降落,从而致使荧光偏振值降低(底图)。

  • 成立并优化荧光偏振检测

    成立并优化荧光偏振检测

    本手艺申明旨在供给信息来赞助用户肯定最好的尝试前提,从而把现有的尝试转化成靠得住的荧光偏振尝试。示例是经常利用于评价受体-配体连系的一种合作性连系尝试范例。假定熟习荧光偏振的根基准绳。

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    IMAP 荧光偏振激酶检测

    IMAP 荧光偏振激酶检测

    卵白激酶对良多细胞历程的调控很是主要。最近几年来,它们已成为癌症及良多其余疾病最主要的药物靶标种别之一。Molecular Devices 的 IMAP® 手艺能够对各类激酶停止疾速、非喷射性测定,并且合用于检测开辟和高通量挑选。

  • IMAP 磷酸二酯酶检测

    IMAP 磷酸二酯酶检测

    IMAP 手艺可为激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶挑选供给一个均相、不基于抗体的平台。它不变靠得住,可发生高品质数据和良好 Z’ 因子值,具备微型化特色,是以合用于按捺剂挑选。差别于一些其余的方式,IMAP 可测定间接连系环境,从而取得更贴切的成果。IMAP TR-FRET 尝试还能间接停止 Km 测定。

    IMAP 手艺

    IMAP 手艺

    迄今为止,咱们已利用喷射性同位素或高特同性抗体测定了激酶活性。针对这个题目,Molecular Devices 接纳其专有的 IMAP® 手艺,供给一种合用于各类激酶的非喷射性、均相测定,而无需斟酌底物肽序列的检测方式。这类测定是一个简略的“夹杂后读取”历程,能够切确测定酶活性。

  • Transcreener ADP2 检测

    Transcreener ADP2 检测

    Transcreener® ADP2 测定属于均相测定,其荧光读数可用来检测和挑选已肯定的药物靶标(包罗卵白和脂质激酶)和新发明的靶标(比方碳水化合物激酶、三磷酸酶、热休克卵白和其余三磷酸腺苷酶)。这类测定基于 ADP 免疫检测。供给三种检测形式来知足用户的检测须要:荧光偏振 (FP)、时候分辩荧光共振能量转移 (TR-FRET) 和荧光强度 (FI)。

    ValitaTITER 尝试

    ValitaTITER 尝试

    ValitaTITER 尝试是一种均相、高通量方式,可在细胞系开辟任务流程中切确疾速定量 IgG。这类 96 孔测定法已在 SpectraMax iD5 读板机和 Molecular Devices 的其余读板机上经由历程荧光偏振检测尝试充实停止了考证,以确保成果靠得住。SoftMax Pro 软件能主动停止规范曲线拟合和样本定量,最大水平削减检测的设置时候。

荧光偏振 (FP) 的资本

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